Sehari Bersama Real Time-PCR

            Halo readers, jumpa lagi dengan saya di postingan yang insyaAllah berfaedah kali ini. Yap, akhirnya saya menemukan bahan baru untuk dibahas di blog saya yang hampir usang ini berkat mengikuti sebuah training. Daripada galau mikirin pacar, yuk mending kita PCR. Pacarannya nanti saja kalau sudah halal. Sekarang kita bahas dulu mengenai metode PCR, tepatnya q-PCR untuk uji halal pada produk makanan.

            Bicara tentang PCR, kalian tahu kan kepanjangannya? Yap, PCR adalah kepanjangan dari Polymerase Chain Reaction, suatu metode yang banyak digunakan di bidang biologi molekuler berupa teknologi untuk mengamplifikasi DNA secara in vitro. Memang banyak sekali aplikasi biologi molekuler yang menggunakan metode ini. Misal, ketika saya magang dan praktik kerja lapangan dulu, teknik ini bisa digunakan dalam metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) untuk mengetahui keragaman genetik suatu populasi atau juga bisa digunakan dalam analisis homozigositas tanaman transgenik beberapa generasi. Nah, itu kalau kita bicara tentang PCR biasa atau PCR konvensional. Gimana kalau Real Time-PCR atau q-PCR?

            Jadi, kemarin saya berkesempatan untuk menjadi salah satu peserta training qPCR  yang diadakan oleh Pusat Riset Pengembangan Produk Halal UNAIR yang bekerjasama dengan Gene Craft Labs, suatu perusahaan distributor alat dan bahan penelitian biologi molekuler. Kalau boleh jujur, training ini worth-it banget, karena biaya registrasinya tergolong murah, yakni hanya 100 ribu saja. Jarang dong training di bidang biologi molekuler dengan harga segitu! Biasanya sih ratusan ribu bahkan bisa sampai jutaan. Ya, meskipun memang training yang saya ikuti tersebut hanya berlangsung sehari. Training kali ini difokuskan pada deteksi DNA babi pada beberapa sampel makanan, seperti daging, bakso, dan sosis dengan metode qPCR alias Real Time PCR. Kenapa kok harus qPCR? Karena eh karena, qPCR memiliki sensitifitas yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan PCR biasa. Bahkan, qPCR mampu mendeteksi DNA babi yang jumlahnya biasanya hanya 1-2 kopi saja di sampel makanan. Bagi yang belum paham benar apa itu qPCR, definisinya adalah suatu metode pengembangan dari PCR yang mampu menghitung jumlah DNA target yang ada pada suatu sampel. Kalau PCR biasa membutuhkan proses lanjutan berupa elektroforesis untuk mengetahui hasilnya, qPCR tidak. Pembacaan hasil diperoleh dari membaca kurva.  Tetapi, sebelum itu, sama seperti PCR biasa, sampel yang akan di-qPCR harus diekstraksi DNA-nya terlebih dahulu. Nah di postingan kali ini, kita hanya akan membahas cara ekstraksi dari suatu daging ya?. Ceritanya kita nggak tahu nih daging itu daging apa dan ada kemungkinan itu daging babi. FYI, tentu saja cara ektraksi itu berbeda-beda tergantung sampelnya, meskipun sebenarnya prinsipnya sama. 

            Cara mengekstraksi DNA daging ada dua, yaitu dengan cara manual dan dengan kit. Kalau pakai kit, biasanya hasilnya lebih baik dan cepat, tapi tentu saja harganya lebih mahal. Kali ini kita akan bahas pakai metode manual. Pertama, sebanyak 25 mg daging dimasukkan ke dalam microtube 2 ml lalu dimasukkan bead/gotri. Kemudian, ditambahkan buffer ATL (suatu buffer lysis). Fungsinya adalah untuk memisahkan sel-sel pada jaringan. Lalu, microtube dimasukkan ke dalam suatu distractor agar sampel daging hancur dan bercampur dengan buffer tersebut. Selain sampel, jangan lupa untuk membuat kontrol. Ada tiga buah kontrol yang direkomendasikan untuk dibuat, yaitu kontrol positif (ada DNA babi), kontrol negative (hanya air free-RNAase), dan kontrol ekstraksi (berisi buffer ekstraksi dan air). Fungsi kontrol adalah untuk melihat apakah hasil akhir yang kita dapatkan nanti akurat dan untuk mempermudah analisis. Oke, setelah hancur, sampel ditambahkan dengan proteinase K, di-sheaker, dan diinkubasi. Sudah pasti fungsinya untuk melisiskan protein pada sel, karena kita hanya perlu DNA inti saja. Setelah itu, masukkan buffer AL dan dihomogenkan. Buffer ini berfungsi untuk melisiskan sel, sehingga DNA dapat keluar. Presipitasi DNA dilakukan dengan menambahkan etanol absolut dan dihomogenkan. FYI, disini kita menggunakan microtube yang ada spin column-nya, jadi DNAnya akan mengendap pada filter, sehingga supernatant dapat dibuang pada tahap ini dengan lebih mudah. Spin column berisi filter DNA ditempatkan pada collection tube baru untuk ditambahkan buffer AW1 dan dihomogenkan. Step selanjutnya masih sama tapi menggunakan buffer AW2. Fungsi kedua buffer ini adalah untuk mencuci debris yang masih nyangkut pada filter DNA agar DNA semakin murni. Selanjutnya, DNA dilarutkan ke buffer AE dan dibiarkan 5 menit untuk melepasnya dari filter. Metode ekstraksi daging, selesai sampai disini Yap, memang beginilah kalau bicara tentang cara kerja genmol. Penuh step-step rinci. Hampir sama seperti belajar memasak. Tapi seru :’). !. Kalau kita bicara sedikit tentang ekstraksi yang menggunakan kit apalagi disertai alat otomatis, caranya lebih gampang. Hanya tinggal memasukkan masing-masing reagen dan sampel pada tempatnya di suatu alat modern, ditunggu beberapa waktu, dan voila! Sudah selesai.

            Oke, kita lanjut ya!. Sebelum masuk ke tahap qPCR, kita harus mengecek konsentrasi dan kemurnian DNA pada sampel dengan nanospektrofotometer. Kemurnian yang baik ada pada rentang 1.8-2.0 untuk DNA. Semakin besar konsentrasi, tentu saja semakin banyak DNA yang berhasil diisolasi. Nah, setelah itu kita lanjut ke tahap adjustment, dimana sampel DNA disamakan konsentrasinya menjadi 100 miligram dengan dilusi memakai air. 

            Tahap selanjutnya adalah pencampuran master mix dengan sampel dan kontrol. Pertama, siapkan lima tube PCR yang sudah diisi masing-masing 10 µl master mix. Kemudian, pada tube kontrol ekstraksi, ditambahkan buffer ekstraksi 10 µl. Pada tube sampel, ditambahkan sampel dan larutan dilusi (air) sebanyak yang telah dihitung. Pada tube kontrol positif, ditambahkan 10 µl larutan DNA babi. Pada tube kontrol negative, hanya berisi air dan master mix saja.  All done? Setelah itu, bisa masuk ke mesin qPCR. Waktu yang diperlukan adalah 82 menit dengan 45 siklus. FYI, umumnya PCR punya tiga siklus, yaitu denaturasi double stranded DNA, annealing atau penempelan primer (babi) pada sisi spesifik DNA, dan elongasi atau pemanjangan primer dengan dNTP. Pada qPCR yang menggunakan probe, Probe hanya akan mengikat sisi DNA yang spesifik saja. Probe ini berbentuk seperti primer tetapi berlabel (F dan Q). Daerah antara kedua label akan mengalami elongasi dan akhirnya berpendar. Pendaran inilah yang dihitung oleh mesin pada qPCR.

            Gimana cara analisisnya? Yaitu dengan bantuan kurva. Pertama, kita cek dulu kontrol internalnya (yellow). Semua kurva yang ideal harus naik semua. Nilai Ct-untuk kontrol internal yang bagus berkisar 28-32. Setelah itu, baru dilihat kurva sampel atau target (green). Secara umum, kurva naik berarti positif, sedangkan kurva mendatar berarti negative. Tetapi, kita harus melihat nilai Ct-nya juga. Jika kurva telah naik melewati threshold, maka bisa dikatakan hasilnya positif. Jika nilai Ct rendah, misal sekitar 22, maka konsentrasi DNA babi tergolong tinggi, tetapi jika Ct-nya tinggi, semisal sekitar 33 atau lebih, maka bisa dikatakan bahwa terjadi inhibit pada reaksi. Penentuan hasil akhirnya adalah jika amplifikasi kontrol internal dan sampelnya positif, maka sampel positif mengandung babi. Jika amplifikasi kontrol internal positif tetapi  amplifikasi sampel negative, maka sampel negative daging babi. Jika keduanya negative, maka proses qPCR gagal. Oh iya, sebelum menganalisis, pastikan nilai Ct dari ketiga kontrol hasilnya masuk akal dan tidak terkontaminasi. 

            Oke, begitulah sekiranya metode dan analisis dari qPCR untuk mendeteksi adanya DNA babi pada makanan. Panjang dan rumit memang, tetapi keren dan penting, kan? Sebagai seorang muslim, kita sudah pasti harus aware dong dengan apapun yang kita makan, sebab makanan yang buruk atau tidak halal nantinya juga akan berpengaruh pada akhlak kita. You are what you eat, isn’t?.

            Sekian apa yang bisa saya bagikan di postingan kali ini. Ternyata diam saja tanpa melakukan apapun tidak akan membawa kita untuk memperoleh sesuatu yang baru, sebab hal baru tersebut hanya akan datang jika kita berani memutuskan, berani memilih, dan berani keluar menghadapi apapun untuk meraihnya. Senang rasanya bisa kembali memegang mikropipet dengan tangan yang memakai gloves biru ukuran M. Senang rasanya bisa kembali berjalan di jalur kita pilih sendiri. Senang rasanya bisa menuliskannya lagi disini. Terima kasih.

Hon Nurizza